橡胶草（ Taraxacum kok-saghyz ，TKS）是一种小型、二倍体、有性生殖、莲座状多年生植物。它属于菊科植物，起源于中国和哈萨克斯坦的天山山区。TKS的根部可以产生大量的天然橡胶（Natural rubber，NR）（高达20%干重），其分子量与巴西橡胶树相似。TKS具有种植面积广、NR含量和质量高、易于种植和收获、成熟时间短等优点，因此TKS是一种具有商业前景的优质NR替代源。然而，高杂合度和自交不亲和导致的近交衰退是将TKS培育成NR生产作物的严重挑战。更好地理解NR生物合成途径和相关基因，以及TKS中相互竞争的代谢途径，将有助于选择合适的经典或生物技术育种策略来改善TKS培育。迄今为止，许多与NR生物合成相关的基因已在TKS和其他NR生产植物中被鉴定。TKS基因组组装于2017年构建，鉴定出40个属于MVA途径的基因、19个参与起始剂合成的基因和20个参与NR合成的基因。然而，关于TKS中NR生物合成的分子机制的知识仍然是不完整和难以捉摸的。

　　更好地理解TK中NR的生物合成，包括识别限速酶和竞争代谢途径，对于定义经典育种策略和生物技术育种策略是必要的。最近发现，使用SMRT测序可以获得全长转录组数据。然而，这项技术尚未应用于TKS，这大大限制了我们对TKS转录组的了解，尤其是对NR生物合成相关基因的了解。在本研究中，采用ONT测序技术获得TKS根的全长转录组，并对具有不同NR含量的TKS组进行比较转录组分析，以探索哪些代谢途径或基因在转录水平上影响或参与NR的合成、调节和积累。这项工作将有助于进一步了解NR生物合成的分子机制，这对于提高TKS的培养效率至关重要。

　　实验材料：野生TKS种群（来自中国新疆天山山区），并将其种植在中国海口橡胶研究所的种质苗圃中。

　　实验方法：测定野生种群中TKS植物的干橡胶含量，从野生TKS群体中选择橡胶含量最高的三个植物（LR-1:2.09%，LR-2:3.09%和LR-3:3.27%）和橡胶含量最高的三个植物（HR-1:9.21%，HR-2:8.92%和HR-3:9.06%）进行转录组分析。利用TKS的自交不亲和性，构建了6个TKS组，并进行了组织培养繁殖。培养物在25◦C温室中培养，且有16小时的光照/8小时的暗光周期（光强度约为13000 LUX）。对于每个品组，总共收集1g组织培养幼苗（4个月龄）的新鲜根，清洁并冷冻。

　　六个样本的平均全长嵌合序列FLNC读取率达到80.68%，平均获得20360个非冗余转录本，平均N50长度和平均长度分别为1607bp和1378bp（表 1），这比之前获得的根转录组数据要好。LR和HR组的平均AS事件分别为1408和1605。可变剪切分析结果显示最常见的剪接类型是内含子保留，LR组占45.41%，在HR组占有46.29%（图1 A）。互斥外显子最不常见，在LR和HR转录组中分别为0.86%和1.04%。APA分析显示具有一个多聚（A）位点的基因数量最高，LR和HR组的平均基因数分别为3896和3733，具有五个多聚（A）位点的转录本数量最低，分别为1242和1386（图1B）。文中共对54135个序列（77606351bp）进行了SSR分析，包括16354个SSR序列和12855个含有SSR的序列。此外，单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的数量分别为5522、4258、6139、176、44和215。其中，三核苷酸SSR的密度最高，为68（图1C）。

　　在HR与LR的比较中确定了3134个DEG；其中，1157个DEG上调，1977个DEG下调（图2）。对HR和LR中的DEG进行KEGG途径富集分析，以揭示代谢机制中的DEG（图3）。发现次级代谢产物生物合成途径（苯丙烷生物合成、倍半萜和三萜生物合成）显著富集，并且这些途径中的大多数DEG在HR组中被下调。相反，在HR组中，参与NR生物合成、光合作用和过氧化物酶体途径的DEG普遍上调。

　　在次级代谢富集途径中，苯丙烷生物合成产生大量次级代谢产物，如二苯乙烯类、二芳基庚烷类、姜辣素、类黄酮等。在HR和LR中，苯丙烷生物合成途径中鉴定出39个DEG（图4A）。在这些DEG中，三个编码苯丙氨酸解氨酶的基因在HR组中被下调，它们催化苯丙烷生物合成的第一步。同样，三个编码反式肉桂酸4-单加氧酶的基因和一个编码咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶的基因被下调。结果表明，需要乙酰辅酶A参与的苯丙烷和许多其他次级代谢产物（二芳基庚烷、姜辣素和黄酮）的合成在HR系中减少。在倍半萜和三萜生物合成途径中确定的四个DEG中，HR组中有三个基因下调（图4B），其中，编码鲨烯合酶的基因是最显著的下调基因。结果表明，HR品系中这些次生代谢物的合成少于LR品系中的合成，表明当IPP用作前体时，NR与诸如五环三萜和甾醇等次生代谢物之间存在竞争。

　　在光合作用途径中，共鉴定出24个DEG，其中21个在HR组中上调（图4C）。相反，在糖酵解的26个DGE和柠檬酸循环的12个DGE中，分别有22个和9个基因下调（图4D和E）。此外，柠檬酸循环中的几个关键基因，例如编码乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶和琥珀酰辅酶A合成酶的基因在HR组中下调。过氧化物酶体是主要参与脂肪酸β-氧化和光呼吸等氧化代谢反应的细胞质细胞器。在过氧化物酶体途径中鉴定出19个DEG，在HR和LR中有12个下调基因和7个上调基因（图4F）。在这些基因中，一个编码过氧化物酶体生物发生蛋白5的过氧化物酶体生物发生基因和一个编码过氧化物酶体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸载体的基因在HR组中上调，后者对脂质降解至关重要。结果表明，在HR株系中可以获得额外的脂源乙酰辅酶A，并且可以用于NR的生物合成。

　　在脂肪酸代谢中，包括亚油酸、α-亚麻酸和花生四烯酸代谢，共鉴定出27个DEG；其中，24个基因在HR组中下调，包括两个编码棕榈酰蛋白硫酯酶的基因、一个编码长链酰基辅酶A合成酶的基因和一个编码三酰甘油脂肪酶SDP1的基因，参与亚油酸、α-亚麻酸和花生四烯酸的合成（图4H）。酮体是葡萄糖的重要替代能源，一个编码羟甲基戊二酰辅酶A裂解酶的基因是催化酮生成的关键步骤，在HR组中被下调（图4H）。

　　在植物激素启动的信号途径中，共鉴定出24个DEG，其中19个基因在HR组中下调，包括两个BAK1基因，它们介导油菜素类固醇（BR）信号（图4I）。此外，参与抗病性的NPR1/NIM1样基因和3个参与茉莉酸反应的TIFY基因在HR株组中也被下调。在植物-病原体相互作用途径中，共鉴定出23个DEG，HR株组中有20个基因被下调，包括植物激素启动的信号途径中的BAK1（图4J）。

　　注：A：苯丙烷生物合成；B：倍半萜和三萜生物合成；C:光合作用；D:糖酵解糖异生；E：柠檬酸循环；F：过氧化物酶体；G：谷胱甘肽代谢；H：脂肪酸和酮代谢；I：植物激素启动；J:植物-病原相互作用。

　　焦磷酸异戊烯基（IPP）作为NR的基本组成部分，通过胞质甲戊酸（MVA）途径或质体MEP途径形成。在MVA途径中，鉴定出七种ACAT，它们催化MVA途径的第一步。其中，ACAT3、ACAT4、ACAT5和ACAT7在高表达水平的HR组中下调，而ACAT2、ACAT6和ACAT8在低表达水平下略微上调（图5）。共鉴定出12个HMGR，其中9个HMGR在HR组中不同程度下调，尤其是HMGR3，其在HMGRs中的表达水平最高。MVA途径中的其余基因，如MVAK和PK、HMGS和MVD，具有相似的表达模式，它们在HR和LR中的差异表达水平不显著（图5）。结果说明MVA途径是TKS根部NR生物合成的IPP的主要来源。

　　在起始剂合成途径中，IPP用作起始剂来合成聚丙烯基二磷酸。在本研究中，编码异戊烯基二磷酸异构酶（IPI）、香叶基二磷酸合酶（GGPS）、香叶基二磷酸合酶（GPS）和法尼基二磷酸合酶的19个基因中没有DEGs （FPS）在HR和LR中（图5），表明引发剂合成可能不是TKS中NR合成的限制因素。

　　在NR合成途径中，CPT是NR在橡胶颗粒上伸长的关键基因。总共确定了六个CPT，其中，表达最高的CPT1在HR组中显著上调（图5）。作为橡胶复合物成分的两种CPTL在HR组中上调，CPTL1的表达水平显著高于CPTL2（图5）。作为结构蛋白和稳定橡胶颗粒的SRPP对NR合成至关重要，共鉴定出8个SRPPs（SRPP1–7,9），在NR生物合成相关的所有基因中表达水平最高。尽管在HR株组中SRPP1和SRPP2显著下调，但表达水平最高的前3个株组的SRPP5、SRPP6和SRPP9明显上调，并且HR株组中SRPPs的总体表达水平也高于LR株组（图5）。涉及橡胶颗粒稳定性的REF在HR组中的表达水平高于LR组。上述结果表明，参与NR合成的关键基因，尤其是CPTs和SRPPs的表达水平与NR产量成正比，这进一步证明了这些基因在NR生物合成中的重要作用。

　　菊粉是一种丰富的代谢物，仅在TKS根部积累，被认为是一种碳储存源，可用于生产NR的乙酰辅酶A。本研究确定了菊粉代谢途径中的三个主要基因。其中，编码蔗糖1-果糖基转移酶（1-SST）的基因在HR组中上调，而编码果聚糖1-果糖基转移酶（1-FFT）的基因下调。然而，在LR和HR组中，参与菊糖合成的两个基因的表达水平没有达到显著不同的水平（图5）。编码1-果聚糖外水解酶（1-FEH）的基因催化菊糖降解，在LR和HR株组中具有相似的表达水平（图5）。上述结果可能表明，LR株系中菊糖的储存量比HR株系中多，HR株系中的游离蔗糖和游离乙酰辅酶A可用于MVA或MEP途径，以促进NR和三萜的产生。此外，菊粉降解可能不是合成MVA和NR的乙酰辅酶A的主要来源。

　　在本研究中，利用ONT技术获得了含有LR和HR组的TKS组的高质量全长根转录组数据，并对LR和HR组进行了比较根转录组分析。结果表明，NR生物合成关键基因的表达水平与NR产量成正比。另一方面，NR与许多其他代谢产物（如倍半萜、三萜、二芳基庚烷、姜辣素、类黄酮等）在使用底物（IPP或乙酰辅酶A）时存在竞争关组。因此，本研究为TKS中NR生物合成的调节机制提供了新的见解。此外，本研究中发现的与NR合成相关的基因或途径将是未来基因改造和分子育种的重要目标。

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